เวลา สองปีผ่านไปนับแต่ที่ ปีเตอร์ ปาร์กเกอร์ (โทบี้ แม็กไกวร์) หนุ่มนิสัยอ่อนโยนได้เดินไปจาก แมรี่ เจน วัตสัน (เคิร์สเตน ดันสต์) หญิงสาวที่เขาหลงรักมาเป็นเวลานาน และตัดสินใจที่จะเดินไปบนเส้นทาง เพื่อทำหน้าที่รับผิดชอบต่อเพื่อนมนุษย์ ในฐานะของ สไปเดอร์แมน ปีเตอร์ต้องเผชิญหน้ากับความท้าทายใหม่ เมื่อเขาต้องดิ้นรนเพื่อรับมือกับ 'ของขวัญและคำสาป' จากพลังของเขา ในขณะที่ต้องรักษาสมดุลย์ของสองตัวตน ทั้งในฐานะซูเปอร์ฮีโร่ ที่ไวเป็นปรอทอย่างสไปเดอร์แมน และการใช้ชีวิตในฐานะนักศึกษามหาวิทยาลัย ความสัมพันธ์ที่ปีเตอร์รักที่สุด กลับต้องตกอยู่ในอันตราย อันเนื่องมาจากการเปิดเผยตัว เมื่อเขาต้องเผชิญหน้ากับวายร้ายหนวดยุ่บยั่บ ที่มีพลังมหาศาลอย่าง ด็อกเตอร์อ็อคโตปุส หรือผู้มีฉายาว่า ด็อค อ๊อคก์ (อัลเฟร็ด โมลีน่า)

ความ ปรารถนาในตัวเอ็มเจที่มีมานานของปีเตอร์ ยิ่งทวีความรุนแรงมากขึ้น เมื่อเขาต้องต่อสู้กับแรงกระตุ้นที่จะละทิ้งชีวิตลับๆ ของเขา และเพื่อประกาศความรักที่เขามีต่อเธอด้วย ขณะเดียวกัน เอ็มเจยังคงใช้ชีวิตเดินหน้าต่อไป เธอหันไปทำงานด้านการแสดง และมีผู้ชายคนใหม่ในชีวิต ส่วนมิตรภาพระหว่างปีเตอร์กับเพื่อนสนิท แฮร์รี่ ออสบอร์น (เจมส์ ฟรังโก้) ต้องตกอยู่ในเงามืด เมื่อแฮร์รี่ยิ่งเพิ่มความพยาบาทในตัวสไปเดอร์แมน ซึ่งเขาถือว่าเป็นผู้ที่ต้องรับผิดชอบ ต่อการตายของพ่อของเขามากขึ้นทุกวัน ชีวิตของปีเตอร์ยิ่งซับซ้อนยุ่งยากมากขึ้น เมื่อเขาต้องพบกับศัตรูรายใหม่ที่ทรงพลังอย่าง 'ด็อค อ๊อคก์' ถึงตรงนี้ ปีเตอร์ต้องเรียนรู้ ที่จะยอมรับในชะตากรรมและพันธนาการ ที่มาพร้อมอำนาจพิเศษในฐานะซูเปอร์ฮีโร่ เพื่อหยุดคนบ้ารายนี้จากแผนการที่ชั่วร้าย...